1、RNA提取（TRIZOL法）
①细胞裂解：取出培养细胞的孔板，弃掉培养基，用PBS清洗2次，加入1mlTRIZOL/孔裂解细胞,轻轻吹打至细胞完全裂解，将细胞裂解液转移至1.5ml无RNA酶的EP管。
②RNA萃取：往上述EP管中加入0.2ml的氯仿，手动剧烈振荡EP管30秒后，静置3min。4℃，12000rpm离心15min。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。
③RNA沉淀：将水相上层(约400ul)转移到1.5ml无RNA酶的EP管。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，轻柔混匀后，静置10min后，于4℃，12000rpm 离心10min；弃上清液得RNA沉淀。
④RNA清洗 ：用75%乙醇（75%乙醇用DEPC水配制）清洗RNA沉淀。混匀后，4℃，12000rpm离心10min。重复此步骤2次。
⑤RNA干燥：小心吸去乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10min。
⑥RNA溶解：往干燥后的EP管中，加入40μl DEPC水/管，用枪反复轻柔吹打几次，使其完全溶解，-80℃保存待用。
2 RNA质量检测
① 浓度测定
用NanaDrop one超微量分光光度计直接检测。
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.0。
③完整性检测
采用琼脂糖凝胶电泳来检测，电泳条件：140V,5min。
3 样品cDNA合成
①反应体系
序号 反应物 剂量
1 逆转录buffer 2μl
2 上游引物 0.2μl
3 下游引物 0.2μl
4 dNTP 0.1μl
5 逆转录酶MMLV 0.5μl
6 DEPC水 5μl
7 RNA模版 2μl
8 总体积 10μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3min，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60min。
③取出后立即95℃干浴3min，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。
4 梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（GAPDH）实时定量PCR
①GAPDH阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 阳性模板上游引物F 0.5μl
3 阳性模板下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 阳性模板DNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10μl
2 内参照上游引物F 0.5μl
3 内参照下游引物R 0.5μl
4 dNTP 0.5μl
5 Taq酶 1μl
6 待测样品cDNA 5μl
7 ddH2O 32.5μl
8 总体积 50μl
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃ 2min，然后93℃ 1min，55℃ 2min，共40个循环。
5 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
序号 反应物 剂量
1 10× PCR缓冲液 2.5 ul
2 MgCl2 溶液 1.5 ul
3 上游引物F 0.5 ul
4 下游引物R 0.5 ul
5 dNTP混合液 3 ul
6 Taq聚合酶 1 ul
7 cDNA 1 ul
8 加水至总体积为 25ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1min；55℃1min；72℃1min）； 72℃延伸5min。
②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×1010，依次稀释至109、108、107、106、105、104几个浓度梯度。
6 待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：
序号 反应物 剂量
1 SYBR Green 1 染料 10 ul
2 上游引物 1ul
3 下游引物 1ul
4 dNTP 1ul
5 Taq聚合酶 2ul
6 待测样品cDNA 5ul
7 ddH2O 30ul
8 总体积 50 ul
轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2min预变性，然后按93℃ 1min，55℃1min，72℃1min，共40个循环，最后72℃7min延伸。
7 实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。
8 电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
